Géntechnológia - genomiális könyvtárak, cDNS, DNS klónozását in vivo
Módszerek DNS-t klónozunk
A genomiális könyvtárak, DNS klónozását in vivo
Miután a DNS-t térhálósított in vitro, meg kell lemásolni.
Vannak két megközelítés a DNS klónozását. Az első megközelítés magában foglalja a bakteriális vagy élesztősejtek többszörösen vezetünk idegen DNS-t. A második módszer egy DNS in vitro amplifikálás.
DNS klónozása in vivo
A mikroorganizmusok létrehozhat két típusú DNS-könyvtárak: és genomi klón (cDNS).
A genomi könyvtárból. Ha a szervezet genomjába vágni, illessze be egy plazmid vagy virális vektor, és bejuttatjuk egy sejtbe, tárolható ebben a formában. Amikor vágás a plazmid vagy fág DNS valószínűségét egészében és változatlan darab a genom elég magas.
Ez a módszer a termelő genomi könyvtár úgynevezett „shotgun szekvenálás”, hiszen ebben az esetben a gén tartalmazza az egyes töredékek.
Alapelvei létrehozása plazmid és virális vektorok átfogó, ezért tartjuk őket a példa a plazmid. Meg kell jegyezni, hogy mivel a vírus-DNS jobb használni DNS fágok, mert van egy nagyobb kapacitású és lehetővé teszi, hogy helyezze be a nagyobb darabokat a genomban.
Tisztított cirkuláris DNS-molekula, kezeljük egy restrikciós enzimmel, így lineáris DNS-t. A celluláris DNS-t kezelünk az ugyanazzal a restrikciós enzimmel, plazmidot adunk, ligázt adunk hozzá. Az így kapott rekombináns plazmid DNS-t, amelyet be lehet vezetni baktérium- vagy élesztősejtek. A plazmid szaporodik, így sok példányban. Számos plazmid hordoz egy gént antibiotikum-rezisztencia, és ha a rekombináns plazmidot egy olyan gén a sejteket könnyen azonosítható nő a közegben egy antibiotikum.
Mindegyik kolónia utóda vagy klónja egyetlen sejt. Tartalmazó plazmidokat egyetlen telepet klón genom DNS és plazmidok aggregált lehet nevezni genomi DNS-könyvtárat. A hátránya ennek a módszernek, hogy a DNS fragmentumokat állítunk elő nagy mennyiségben. Vágás esetén genomiális DNS-t határozzuk meg, így csak egy része a fragmensek teljes géneket. Egyes fragmenseket csupán egy részét tartalmazhatja egy gén vagy intronszekvenciákat.
cDNS-könyvtár. Készítése cDNS-szintézis kezdődik RNS-templát alapján reverz transzkriptáz komplementer DNS-szál. Ezután létre az alapvető feltételeket elpusztítani RNS-szál nukleotidjainak, majd a DNS-polimeráz szintetizál egy komplementer DNS-szálat. Ez képezi egy olyan DNS-fragmentumot tompa végű. Az ilyen DNS-t plazmidba inszertáltuk, és bevezetjük egy bakteriális sejt. Ha a plazmidot amplifikációs generált klón komplementer DNS másolatot (cDNS).
Előnyök DNS klónozására genomiális DNS klónozására, hogy egy olyan fehérjét kódol, a nukleotid szekvencia a gén nem megszakadt.
A gének eukarióták tartalmaznak intronokat, amelyek el kell távolítani a transkriptnoy RNS konvertálása előtt egy mátrixba, majd splicing (splicing). A bakteriális sejtek nem tudja elvégezni ilyen módosítást a képződő RNS transzkripcióját az eukarióta sejtek gén. Ezért, ha folytat fehérje készítmény expressziójával egy klónozott gén, akkor jobb, hogy egy cDNS-könyvtár alapján készített hírvivő RNS.
További fejezetek ez a rész: