Immuncitokémia poliklonális és monoklonális ellenanyagok
Immuncitokémia poliklonális és monoklonális ellenanyagok
antigén kölcsönhatás antitestével - egy példa a nagyon specifikus molekulák közötti kölcsönhatások. Emiatt, a módszerek alkalmazásával jelölt antitestek bizonyult a leghasznosabb a felismerésére és lokalizálására specifikus fehérjék és glikoproteinek.
A szervezetben vannak sejteket. akik meg tudják különböztetni a saját molekulák (azok) Alien. Válaszul a külföldi ismert molekulák, mint antigéneket, a szervezet termel egy fehérjét - antitest - amelyek specifikusan reagálnak az antigénnel, és kötődnek, ezáltal eltávolítását megkönnyítő idegen anyag. Antitestek - fehérjék, amelyek a család, amely számos immunglobulinok.
A immuncitokémiai vizsgálatok, szöveti metszeteket (vagy sejtek tenyészetben), amelyek tartalmazhatnak specifikus fehérjék inkubáljuk tartalmazó oldatban a fehérjére vonatkozó antitestek. Antitestek specifikusan kötődnek egy fehérje, amelynek lokalizációs követhető világos vagy elektronmikroszkópiával, típusától függően az alkalmazott vegyület az ellenanyag jelölésére.
Az egyik legfontosabb követelmény az immuncitokémiai módszerek - azonosítani az antitestek jelenlétét a proteinhez. Ez azt jelenti, hogy szükség előzetes tisztítását és izolálását a fehérje úgy, hogy volt lehetséges antitest.
Poliklonális és monoklonális antitestek
Feltesszük, hogy a cél az, hogy elleni antitestet kinyerjük a fehérje X különböző állatfajok (például patkány) vagy humán. Abban az esetben, ha protein-X már kiosztott, amelynek beadjuk egy állatnak egy másik faj (például, nyúl vagy kecske).
Ha a fehérje különböző, így az állat felismeri, hogy a külföldi, azaz antigénként, az állat fog antitesteket erre a fehérje (például nyúl antitestek a fehérje x patkány vagy kecske anti-humán fehérje x). Ezek antitesteket kapunk állati plazmában, és használják a immuncitokémiai.
Több csoport (klónok) állati limfociták, amelyek beléptek x fehérjét felismerni a különböző részeit a fehérjemolekula, minden csoport antitesteket termel a megfelelő részével. Az ilyen antitestek poliklonális antitest keverék.
Lehetséges azonban, hogy befolyásolják a fehérje nalimfotsity található a sejttenyészetben (sőt, a limfocitákon, kombinálva daganatsejtek). Egyedi klónjait limfociták antitesteket termelni, hogy több különböző részeit a fehérjemolekula. Megadhatja az egyes klónok és ápolják magad - úgy, hogy a különböző antitestek a fehérje kaphatott külön-külön.
Az így kapott antitest - egy monoklonális antitest. Számos előnye, hogy segítségével a monoklonális antitestek, mint poliklonális például monoklonális antitesteket ki lehet válogatni a magas specifitással és kötődési aktivitást egy detektálható fehérje. Ezért, kevesebb lesz a nem-specifikus kötődés más fehérjékkel hasonló vizsgálták.
Közvetlen immuncitokémiai módszer alapja az antitestek (monoklonális vagy poliklonális), hogy kell címkézni egy megfelelő címkét. A szöveti metszeteket antitesttel egy ideig, annak érdekében, hogy a kölcsönhatás bekövetkezett, és kötődését fehérje elleni ellenanyagok x.
A szelet mossuk, hogy a kötetlen antitestet eltávolítsuk. Attól függően, hogy az alkalmazott címke (fluoreszcens vegyület, enzim, aranyrészecskék) szelet lehet vizsgálni a fény vagy elektron mikroszkóppal.
Ha a védjegyet használják, vagy más peroxidáz enzim tanulmányozására vágott szövetet, ez az enzim azonosítani kell a mikroszkóp alatt. Sok szöveti metszeten tartalmazó belokh fluoreszkálnak, lesz borított aranyrészecskék vagy sötét üledék, ha szolgált a marker enzim.
Közvetett immuncytokémiai eljárás jobb érzékenységet, de ehhez nagyobb számú szakaszaiban. Tegyük fel, hogy a célunk az, hogy olyan fehérjék azonosítására, amelyek patkányokban. Mielőtt kiadások immuncytokémiai reakció elvégzésére két eljárást:
(1) először meg kell szerezni antitesteket (poliklonális vagy monoklonális), hogy a fehérje x patkány egy állatban egy másik faj (például nyúl);
(2) normál immunglobulin párhuzamos (nem kapnak injekciókat) adjuk be egy nyúl állat harmadik fajok (például, kecske).
A nyúl immunglobulinok amelyek idegen kecskék, és ezért képesek indukálni az állatban ellenanyagok termelését (antitestek antitestekhez vagy antiimmunoglobulinov).
Közvetett kimutatás immunotsitotohimicheskoe kezdetben szövetek vágására inkubálását patkány fehérje, amely x, nyúl fehérje elleni ellenanyagok x. Mosás után a metszeteket inkubálunk jelzett kecske anti-nyúl antitestekkel. Ezek az antitestek kötődni fognak a antitestek nyúl antitestekkel, amelyeket előzőleg érintkezésbe a fehérje.
Protein x tovább lehet kimutatni egy mikroszkópos módszer, a megfelelő megfelelő jelölés jelölést a másodlagos antitesttel. Vannak más indirekt módszerek alkalmazásával más köztes molekulák, mint például a technika, hogy a biotin-avidin.